Праймер база топ последовательность: Пошаговая технология нанесения гель-лака

База Топ Последовательность – Telegraph

🛑 👉🏻👉🏻👉🏻 ИНФОРМАЦИЯ ДОСТУПНА ЗДЕСЬ ЖМИТЕ 👈🏻👈🏻👈🏻

Медицинскими препаратами 44%, 41 голос
Народными средствами 32%, 30 голосов

Каждая девушка мечтает за 3 дня отрастить ногти в домашних…

При создании миндалевидной формы ногтей нужно соблюдать ряд правил, учитывать…

Мамам дочерей приходится задуматься над тем, со скольки лет можно…
При выборе средства для лечения, вы руководитесь
Информацией из Тв и интернета 34%, 20 голосов
© 2021 Все права защищены. Информация на сайте предоставляется исключительно в справочных целях. Не занимайтесь самолечением. При первых признаках заболевания обязательно обратитесь к специалисту.
До недавнего времени наращивание ногтей шеллаком можно было выполнить только в салоне, заплатив за это ощутимую сумму. Сегодня даже новичок справится с этим видом маникюра, опираясь на статьи и обучающее видео.
Начинающие мастера иногда путают, что наносить сначала – топ, или базу. На самом деле, маникюр выполняется не в два этапа, а в три. О них мы и расскажем далее.
Перед началом маникюра или педикюра обязательно подготовить ногти: удалить кутикулу специальным средством, маникюрными щипчиками или фрезером, затем оформить пластины. На подготовленные пластины наносится покрытие в следующей последовательности:
Это стандартный порядок действий, которым ни в коем случае нельзя пренебрегать. В промежутке между этапами слои высушиваются в лампе и обезжириваются. Игнорирование любого из этапов сведет к минимуму попытки создать качественный ноский маникюр. Первые сколы появятся уже через один-два дня, шеллак придется обновлять.
Иногда мастера в поисках новых подходов пытаются заменять том и базу друг другом. Это в корне неверный подход, так как каждая из жидкостей обладает определенными свойствами и функциями.
Благодаря нанесению основы, ногтевая поверхность станет ровной и гладкой, будет защищена от воздействия нанесенного следом пигмента. Также, благодаря ей, декоративный слой будет крепче держаться за счет улучшенного сцепления.
Перед нанесением основы ногти обрабатываются стандартным способом – удаляется кутикула, создается форма, ногти шлифуются и обезжириваются. Порядок выполнения:
Для достижения ровного слоя можно воспользоваться хитростью мастеров после нанесения базы перевернуть руки ногтями вниз, чтобы жидкость равномерно распределилась по пластине. По завершению сушки липкий слой удаляется, наступает черед декоративного покрытия.
В линейке средств для наращивания выпускаются также средства «2 в 1», выступающие одновременно и топовой, и финишной жидкостью. Это очень удобно, особенно начинающим мастерам, путающимся, в какой последовательности наносить базу и финиш. Однако в профессиональной среде такие средства считаются нестойкими. Для получения стойкого наращивания лучше использовать на каждом этапе отдельную жидкость.
Иногда даже хорошая жидкость может плохо закрепляться, поэтому приходиться экспериментировать в поисках подходящего бренда. Но не стоит заменять этапы, пытаясь создать более стойкий маникюр. Можно повредить пластины и лишиться наращивания, потребовавшего много времени и сил. Однако можно обойтись без декоративного слоя, нанеся топ сразу после базы, предварительно избавившись от липкого слоя.
В качестве цветного слоя в наращивании используется гель разных оттенков. Наносится он вторым этапом, после базовой жидкости. Для насыщенных расцветок достаточно 1-2 слоя, бледные тона можно нанести до 4 раз. Высушив цветной гель, наносят рисунок или декоративные элементы.
Главное на этом этапе – наносить гель аккуратно, не испачкав кожу вокруг пластины. Качество нанесения зависит также от того, насколько ровно выл выложен базовый слой.
Финишным слоем наносится топовая жидкость, предназначенная защитить декоративный слой от механического или химического воздействия. Если проигнорировать этот этап, можно быстро лишиться украшения на своих ногтях. Кроме того, топ позволяет добиться глянцевого блеска или матового покрытия. Также на топ можно крепить декоративные элементы.
У мастеров маникюра расходятся во мнениях, нужно ли снимать липкий слой на каждом этапе, можно ли подпиливать ногти после финишного покрытия  и есть ли необходимость запечатывать ли торец. Каждый, кто выполняет наращивание дома или в салоне, сам решает на практике, после каких действий маникюр держится лучше. Главное, придерживаться правила: сначала база, потом — топ.
От соблюдения правильной последовательности во время наращивания ногтей гелем зависит качество и длительность носки работы.

Что делать если слоятся и ломаются ногти на руках.
Женщина, желающая и во время беременности делать маникюр
Современную, ухоженную девушку трудно представить без
Акриловую пудру чаще применяют для дизайна ногтей или
Этот сайт использует cookie для хранения данных. Продолжая использовать сайт, Вы даете свое согласие на работу с этими файлами. OK
Вы – любительница необычного, а долговечного маникюра? Любите, чтобы ноготки были идеальны без коррекции 2 -3 недели? Тогда вы точно  знаете, где в городе можно сделать маникюр по самым выгодным ценам, где работает хорошие мастера, где лучшие материалы. А особо продуманные обзавелись лампами, шеллаками, базой и топом и вовсю экспериментируют дома. Если вы полагаете, что основа и финишное покрытие в этом деле – нюанс, которым можете пренебречь, то очень ошибаетесь. Стандартный алгоритм гласит: база и топ, а посередине шеллак. Иного не дано, сохраняется и последовательность. Иначе не только ваши труды будут напрасны – покупка лампы для полимеризации и шеллака понравившегося цвета будет пустой тратой денег. Это трио друг без друга не может  долго жить. Как же выбрать составляющие, которые определяют долговечность и защищенность ногтевой пластины и маникюра? Почему одни вам подойдут, а другие – нет, и от чего это зависит?
Примем как должное, что база под пигментом должна быть всегда (кстати говоря, даже при маникюре обычным методом, обычными лаками).
Базовое средство в маникюре шеллаком необходимо для:
А теперь поговорим простым языком о том, как правильно использовать праймер (базу), чем это сделать и какой при этом должна быть поверхность ногтя:
Только теперь можно наносить понравившийся цвет, отступая от кутикулы на 1 миллиметр (если вы только вникаете в этот творческий процесс, не являетесь профессионалом с поставленной к этому процессу рукой).
Завершающим этапом маникюра (но перед нанесением ухаживающих масел) обычно есть нанесение и сушка топа.
Топ-гель (топ, финиш, финиш-гель) предназначен для:
Топ-покрытие тоже имеет особенности и четкие правила:
Если во время нанесения и сушки вы придерживались технологии, последовательности, то маникюр продержится пока отрастет ноготь, и не появится необходимость его коррекции из чисто эстетических соображений. К тому же натуральная ногтевая пластина будет защищена надежно, а значит, вы почувствуете еще одно важное преимущество шеллака.
Оба этих вещества прозрачные или слегка мутные, имеют немного вязкую консистенцию. В зависимости от производителя время просушки может отличаться.
Отметим, что лет 5 назад на рынке представили цветной топ-гель без дисперсионного (липкого) слоя. Однако современные однофазные гель-лаки сами по себе после помещения в УФ-лампу наделяются этими же функциями. В этом случае топ-покрытием можно пренебречь.
База и топ – защитная оболочка, которая правильно надежно охватывает и защищает декор или сплошное покрытие шеллаком, замыкая круг на кончике ногтя.
Чтобы базовый состав и финиш полностью выполняли свои функции, а значит — продлили жизнь маникюру, защитили натуральный ноготь, нужно потрудиться их правильно выбрать, в соответствии с маркой гель-лака. Если вы предпочитаете шеллак, тоже надо подобрать соответствующие средства. Вам помогут общие правила и знание нескольких нюансов:
Заменить базу и топ нельзя ничем, вместо них не подойдет никакое средство, и отличаются они очень сильно, так что выбор делать придется. И не факт, что он сразу будет правильный.
В любом случае нужно проконсультироваться с мастером или грамотным продавцом, либо консультантом. Или запомните наши рекомендации и потом отправляйтесь за удачными покупками.

Последовательность нанесения гель-лака: техника нанесения базы , геля…
Топ и база — какая очередность? Пошаговая инструкция по маникюру.
Что сначала наносится топ или база : все от А до Я
Что первое – база или топ
Ответы Mail.ru: Праймер, база , топ , в каком порядке?
Venzel Гель Лак Купить
Маникюрный Набор Zinger Купить В Туле
Шампунь Оллин Красный
База Топ Последовательность

Как правильно наносить гель-лак

Ухоженные ногти – важная составляющая имиджа настоящей женщины. Чтобы следить за их красотой требуется время и деньги. Использование гель-лака – это не просто дань моде, а очень универсальный и прочный материал, благодаря которому руки достаточно долго выглядят идеально. В салонах красоты хорошие мастера берут немалые деньги за свою работу. Однако сделать маникюр и нанести гель лак в домашних условиях тоже возможно. Для этого нужны соответствующие материалы, оборудование и навыки.

Что такое гель-лак и какой он бывает

Как можно судить из названия, покрытие совмещает в себе свойства обычного лака и геля для наращивания ногтей. Этот интересный гибрид был создан компанией CND в 2010 году и вышел на рынок под названием Shellac. Прочность его обеспечивалась за счет полимеризации и затвердевания под действием УФ-лучей. Поэтому нанеся его как обычный лак, не нужно было долго сушить ногти, и, что самое главное, красивое покрытие держалось в течение нескольких недель.

Новинка так понравилась покупательницам, что и другие фирмы использовали эту идею, создавая подобные продукты. В итоге название Шеллак стало нарицательным и иногда используется как синоним гель-лака. Обращаясь к продавцу в профессиональном магазине, следует уточнять, хотите вы приобрести именно марку Shellac или вас интересуют и другие бренды гибридных лаков.

Ассортимент подобных средств теперь очень широк. При покупке следует знать, в чем разница между ними. Существуют трехфазные, двухфазные и однофазные варианты. Наиболее прочным и популярным является трехфазная структура лака. Это значит, что придется наносить три слоя:

• базу;
• цветное покрытие;
• финишный состав.

В двух других случаях лак совмещает в себе другие свойства, и достаточно нанести его один раз (однофазный), либо обойтись без базы, так как она уже есть в составе (двухфазный).

Подготовка ногтей к маникюру

Перед нанесением лака нужно выполнить предварительный маникюр. Для этого понадобятся:

• Стандартный маникюрный набор.
• Ремувер.
• Баффик.
• Дегидратор.
• Праймер.

Руки следует вымыть и высушить. Пилочкой и при необходимости ножницами подкорректировать форму ногтевой пластины, затем нанести ремувер и убрать кутикулу (сдвинуть или отрезать). Далее идут специфические процедуры, без которых гель лак не будет хорошо держаться. Нужно обработать поверхность ногтя баффиком, чтобы приподнять роговые чешуйки верхнего слоя. Это обеспечит хорошее сцепление с базой. Затем удаляется, опил, и ноготь обрабатывается дегидратором. Потом наносится праймер для удаления остатков жира и улучшения сцепления с базой.

Основные этапы нанесения гель-лака

Рассмотрим последовательность нанесения гель-лака, трехфазный вариант, так как это наиболее сложный способ. Но он самый распространенный, так как держится такое покрытие дольше. Не забывайте с каждым покрытием запечатывать – замазывать торец (место спила) ногтя.

Первый слой — база

Базовый слой выполняет не только роль улучшения скрепления с цветным лаком, но и выравнивает поверхность, а также предохраняет ноготь от вредных веществ последующих слоев. Если ногтевая пластина ровная, достаточно одного слоя: наносим равномерно, запечатываем и помещаем под Led лампу на 30 секунд (если используете УФ лампу, то на 2 минуты). Если хочется еще выровнять поверхность, можно тем же способом нанести второй слой.

Красящее покрытие

Когда база нанесена, можно красить выбранным цветом. Его нужно нанести очень аккуратно и идеально ровно. Чтобы добиться этого придется потренироваться. Новички в этом деле могут даже сначала попробовать сделать несколько мазков на бумаге. Один из приемов мастеров следующий: кисть ставится сначала с одной стороны, ближе к основанию ногтя, слегка сдвигается к кутикуле и затем одним мазком движется к концу ногтя. Все то же повторяем с другой стороны и затем в середине.

Для запечатывания с кисти убирают излишки лака, и, держа ее вертикально, боковой частью прокрашивают торец. В случае с короткими ногтями используют тонкую кисть. Затем нужно стереть случайно попавший на кожу лак. Технология сушки под лампой та же, что и в случае с базой. Если цвет ненасыщенный, одного слоя недостаточно. Обычно приходится красить в 2 – 3 приема, каждый раз просушивая лак с помощью лампы. И с новым слоем не забываем запечатывать торец. 

Украшающие элементы (фольга, наклейки, втирка и т.д.) наносятся на последний слой, если нет особого указания в инструкции к ним. Рисунки, выполненные тонкой кисточкой цветными лаками, также полимеризуются под лампой в течение стандартного времени.

Завершающая, но не самая последняя ступень — топ

Последним слоем служит топовое покрытие – прозрачный гель лак, обеспечивающий идеальную поверхность. Технология его нанесения ничем не отличается от первых слоев. При этом следим, чтобы состав имел равномерную толщину везде. Важно добиться, чтобы световой блик располагался в самой середине ногтя и был ровным. Запечатывать можно, слегка заходя концом горизонтально расположенной кисти на торец. Сделать это нужно в качестве завершающей фазы мазка по ногтю. Последний слой помещаем под лампу на более длительное время – 1,30 минуты.

Финишная обработка клинсером

Последняя процедура – удаление липкого слоя. Для этого нужно смочить безворсовую салфетку клинсером и протереть ногтевую пластину. Заменить специализированное средство можно также спиртом, ацетоном или составом для удаления обычного лака.

Выводы

Технология нанесения гель-лака сложнее, чем в случае с обычными лаками, здесь нужна сноровка и определенный опыт. Также важны качество используемых материалов и лампы. Так, рекомендуется подбирать УФ лампы на 36 Вт и использовать высококачественные лаки от зарекомендовавших себя на рынке брендов. Набравшись опыта, можно самостоятельно делать современный эффектный маникюр, который будет  держаться около месяца.

Разработка праймера – Пошаговая демонстрация

Оглавление

Добавьте заголовок, чтобы начать создание оглавления

Введение

В этой статье показано, как создавать праймеры (прямые и обратные) для различных типов методов клонирования.

Дизайн праймера продемонстрирован с использованием гена Dsup (подавитель повреждений) тихоходки (водяной медведь). Тихоходки — очаровательные животные с экстраординарными способностями справляться с экстремальными условиями, такими как космический вакуум, высокой устойчивостью к ультрафиолетовому излучению, устойчивостью к высоким и низким температурам. Белок Dsup — это недавно открытый ген, который придает устойчивость к ультрафиолетовому излучению, покрывая себя ДНК.

Для амплификации любой последовательности ДНК необходимы два праймера. Один называется «прямой праймер», а другой — «обратный праймер». Прямой праймер синтезирует верхнюю цепь, используя нижнюю цепь в качестве матрицы. В то время как обратный праймер использует верхнюю цепь в качестве матрицы и синтезирует нижнюю цепь.

Хотя названия предполагают, что они создают копии разных нитей, их названия зависят от направления нити, используемой для усиления.

Прямой праймер создает копии 5’-3’-цепи, тогда как обратный праймер создает копии комплементарной (3’-5’) нити.

В случае, если взять комплементарную последовательность и использовать ее для конструирования праймера (располагая последовательность в 5’-3’), обратный праймер в приведенном выше примере теперь действует как прямой праймер.

Следующие материалы посвящены демонстрации разработки праймеров для различных методов клонирования. Чтобы продолжить, откройте последовательность Dsup по этой ссылке.

Мы используем бесплатное программное обеспечение APE (A Plasmid Editor) для разработки праймеров. Вы можете скачать копию по этой ссылке.

Этапы проектирования праймера остаются прежними, даже если вы используете другой инструмент.

Разработка прямого праймера

Рис. 1. Последовательность, выбранная для создания прямого праймера (текст, выделенный синим цветом, указан стрелкой). Красное поле указывает параметры выбранной последовательности, такие как T _m , длина последовательности и GC%.

Ниже приведены этапы разработки переднего праймера:

1. Мы скопировали 9Нуклеотидную последовательность гена 0011 Dsup с портала NCBI (упомянутого выше) и вставили в инструмент APE. Он начинается со стартового кодона (ATG) и заканчивается стоп-кодоном (ТАА). Последовательность гена имеет направление от 5’ к 3’. Обратите внимание, что здесь представлена ​​только одна цепь ДНК. Некоторые инструменты, такие как snapgene, будут отображать обе нити.
2. Прямой праймер разработан путем выбора нуклеотидной последовательности от ATG до таких параметров праймера, как содержание GC и Т _m (температура плавления) соответствует расчетным параметрам грунтовки.

Несколько параметров выбранной последовательности можно просмотреть в разделе заголовка инструментов (красное поле). Параметры обновляются в режиме реального времени, поэтому вы можете выбрать или отменить выбор нуклеотидов в соответствии с требуемыми критериями.

  Для большинства случаев предпочтительна T _m в пределах 55-62°C, а содержание GC составляет 40-60%.

3. В приведенном выше примере длина праймера составляет 20 нуклеотидов, T _m составляет 56,8°C (~57°C), содержание GC составляет 50%. Таким образом, эта последовательность может работать как прямой праймер. Кроме того, последовательность заканчивается на «С», что выгодно, поскольку она меньше колеблется, пока полимераза работает над удлинением праймера.
4. Поскольку последовательность идет от 5’ к 3’, прямой праймер можно заказать напрямую. Таким образом, последовательность прямого праймера для заказа — «ATGGCATCCACACACCAATC».
5. Обратите внимание, что мы не упоминаем, что это 5’-ATGGCATCCACACACCAATC-3’. Как правило, последовательности ДНК следует указывать с 5’-3’, а последовательности белков — с NC-конца.
6. Приведенная ниже иллюстрация (рис. 2) дает хорошее представление о том, как устроен прямой праймер и как он используется в реакции ПЦР.

Рис. 2.   Иллюстрация, изображающая дизайн прямого праймера и его участие в ПЦР. 2.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. Синяя лента указывает на грунтовку. 2.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. 2.3 Связывание праймера с комплементарной цепью. 2,4 Удлинение грунтовки для создания верхней пряди (5’-3’).

Разработка обратной грунтовки

Разработка обратной грунтовки — довольно сложный процесс. Отчасти проблема связана с тем, что таким образом мы передаем последовательности ДНК. Другая половина проблемы заключается в том, что мы должны работать с нитью-шаблоном, чтобы разработать праймер для другой нити.

Какими бы ни были проблемы, с помощью таких инструментов, как APE, разработка обратного праймера выполняется одним нажатием кнопки. Выполните шаги, указанные ниже, чтобы получить обратную последовательность праймера.

1. Обратный праймер был разработан с конца последовательности, которую мы добавили к АРЕ.

2. Необходимо помнить об одном важном моменте: следует ли включать стоп-кодон в праймер или нет. Этот критерий зависит от последующего рабочего процесса. Например, если вы хотите добавить метку (флуоресцентный белок или короткий пептид и т. д.) к С-концу белка, вам необходимо удалить стоп-кодон из обратного праймера, чтобы метка могла слиться во время трансляции. Если вашей целью является субклонирование гена или экспрессия белка без меток на С-конце гена, вам придется включить стоп-кодон, чтобы предотвратить трансляционное слияние векторных последовательностей. В этой демонстрации мы включаем стоп-кодон.

3. Как и в прямом праймере, последовательность выбиралась до тех пор, пока такие параметры, как содержание GC, и T _m не соответствовали желаемым значениям. Рекомендуется сохранять параметры (T _m и содержание GC) как можно более близкими для прямого и обратного праймера (рис. 3).

Рисунок 3. Последовательность, выбранная для разработки прямого праймера (текст, выделенный синим цветом, указан стрелкой). Красное поле указывает параметры выбранной последовательности, такие как T _м , длина последовательности и GC%.

4. Поскольку матричная последовательность имеет направление от 5’ к 3’, обратный праймер нельзя заказать напрямую. Его необходимо обратно дополнить.

5. Для обратного дополнения скопируйте последовательность (ctrl+c или cmd+c) и вставьте последовательность (ctrl+v или cmd+v) в новом окне (рис. 4.1). В заголовке APE есть кнопка для обратного дополнения последовательности. Выберите последовательность праймеров (если она еще не выбрана) и нажмите кнопку (рис. 4.2).

Рисунок 4. Изображение, показывающее этапы обратной комплементации в программном обеспечении APE. 4.1 Кнопка для создания нового файла/окна. 4.2 Кнопка для обратной комплектации.

6. Перепроверьте, была ли последовательность обратно дополнена или нет.

7. До обратной комплементации последовательность 5’-CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’, а после обратной комплементации 5’-TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3’.

8. Кроме того, вы можете обратно дополнить последовательность без копирования и вставки последовательности в новое окно. Но мы не рекомендуем его, так как он изменяет исходную последовательность в файле.

Объяснение обратной комплементации

Двухцепочечная ДНК проходит в направлении от 5’ к 3’ с комплементарной парой оснований A=T и G=C. Поскольку мы показали только одну цепь ДНК (5’-3’ цепь), из нее необходимо извлечь последовательность обратных праймеров. Как упоминалось ранее, представление последовательностей ДНК является общим понятием. Если вы предоставляете последовательность ДНК компании, синтезирующей праймеры, они всегда предполагают, что вы записали последовательность в направлении 5’-3’ и синтезируют в том же порядке. Если вы не выполняете обратную комплементацию выбранной последовательности (с верхней цепи / 5′-3′ цепи), вы получите еще один прямой праймер, который начинается с конца интересующего вас гена (рис. 5).

Рисунок 5. Иллюстрация, показывающая важность обратной комплементарности. 5.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. 5.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. 5.3 Связывание праймера с комплементарной цепью и удлинение праймера. полимеризация приводит к синтезу верхней цепи (5’-3’). Это действие эквивалентно действию прямого праймера.

Обратное дополнение состоит из двух шагов.

1. Комплементарная последовательность — это последовательность противоположной цепи, но направленная в том же направлении. Например, комплементарной последовательностью 5′-ATGC-3′ будет 5′-TACG-3′. Применение того же принципа к последовательности, выбранной для праймера, т.е. 5’-CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’, приводит к 5’-GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3’. Комплементарная последовательность не может связываться ни с одной из цепей из-за отсутствия направленности или комплементарности.
2. Итак, второй шаг включает изменение направления комплементарной последовательности на противоположное. Изменение направления просто меняет 5′ на 3′ и наоборот. Это превращает 5′-TACG-3′ в 3′-TACG-5′. Как обсуждалось ранее, последовательности ДНК должны быть записаны в направлении 5′-3′ (как говорит Джон Вик «Правила!»). Таким образом, последовательность меняется с 5′-TACG-3′ на 5′-GCAT-3′. Использование того же принципа для нашей комплементарной последовательности праймера изменит последовательность с 5’-GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3’ на 5’-TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3’.

Тот же процесс представлен на иллюстрации ниже (рис. 6).

Рисунок 6.   Иллюстрация, изображающая дизайн обратного праймера и его участие в ПЦР. 6.1 Двойная спираль ДНК показана бирюзовым цветом. Последовательность, обведенная синим открытым прямоугольником, используется для обратного праймера. Синяя лента указывает на последовательность праймеров, выбранную для дизайна обратного праймера. обратная комплементация содержит два шага (дополнение и изменение направления). 6.2 Дуплекс ДНК раскручивается в реакции ПЦР. Праймер связывается с верхней нитью (5′-3′). Направление полимеризации в стойке матрицы скорее вне последовательности, как это происходит без обратной комплементации. 6.3 Удлинение праймера с образованием нижней нити (3’-5’).

Параметры проектирования грунтовки

При разработке грунтовки необходимо следовать определенным правилам. Некоторые из них обсуждались ранее (T _m и GC%). Посмотрим сейчас на остальных.

• Длина праймера обычно составляет от 12 до 30 оснований. 30 оснований не является жестким правилом, но указывает на увеличение вероятности вторичных структур.
• Передняя и обратная грунтовки не должны иметь разницы T _m более 5°С.
• Если вам интересно, как рассчитать T _м, вот формула: 2(A+T)+4(G+C) или 2(wA+xT)+ 4(yG+zC) (w,x , y и z — количество соответствующих нуклеотидных остатков в данной последовательности праймеров).
• T _m – температура, при которой половина ДНК является одноцепочечной. На Т _м 55-62 капсюли подействуют лучше.
• Содержание ГХ в грунтовке должно поддерживаться на уровне 40-60%. Содержание GC 40-60% обеспечивает стабильную ассоциацию праймеров для связывания их последовательностей-мишеней. Потому что GC имеет тройную водородную связь по сравнению с парами оснований AT, которые имеют две водородные связи.
• Последняя последовательность праймера на 3’-конце должна заканчиваться на G или C, известную как Хлопок ГК . Тройная водородная связь уменьшает колебания, что дает полимеразе больше шансов пойти на удлинение праймера.
• Праймер не должен содержать более трех нуклеотидов G или C в последних 5 нуклеотидах (3′), поскольку он может неспецифически связываться где-то еще (спаривание G-C более стабильно, чем спаривание A-T).
• Праймер не должен содержать повторяющихся последовательностей, поскольку они могут образовывать вторичные структуры, тем самым подавляя реакцию ПЦР.
• Прямой и обратный праймеры не должны иметь комплементарных последовательностей. Это может привести к амплификации праймеров, что приводит к димеру праймеров. Димеры праймеров изолируют ресурсы, которые предположительно доступны для амплификации храмовой ДНК.
• Для некоторых последовательностей (промоторы, последовательности 5′- и 3′-UTR) получение идеальных параметров праймера, таких как длина праймера, T _m и содержание GC, затруднено, поскольку они представляют собой AT-богатые последовательности. В этой ситуации необходимо расставить приоритеты T _m .

Хотя мы упомянули идеальные условия для создания праймеров, не всегда возможно контролировать выбор последовательности (например, амплифицирующий ген из стартового кодона). В этих случаях необходимо изменить стратегию разработки праймеров или стратегию амплификации.

Вышеупомянутое руководство по проектированию демонстрационных работ для некоторых методов клонирования, таких как

TA клонирование

Клонирование с тупым концом

Клонирование TOPO TA

Клонирование TOPO с тупым концом

Однако потребуются другие методы дополнительные последовательности, помогающие лигирование/рекомбинация или определение направленности вставки.

Разработка праймеров для направленного клонирования ТОРО (D-TOPO)

Клонирование D-TOPO предлагает одну из самых простых модификаций среди методов, требующих модифицированных последовательностей праймеров. Клонирование D-TOPO позволяет клонировать вставку в одном конкретном направлении, а не с вероятностью 50-50, как это наблюдается в упомянутых выше способах клонирования. Это достигается коротким отрезком из 4 нуклеотидов «САСС», которые добавляются к 5′-концу прямого праймера. И никаких особых модификаций последовательности (дополнений или делеций) обратного праймера. В следующей таблице приведено сравнение праймеров, разработанных для различных методов клонирования.

Addgene: Protocol — Как разработать праймеры

Дизайн праймеров для ПЦР

Олигонуклеотидные праймеры необходимы при проведении реакции ПЦР. Необходимо разработать праймеры, комплементарные матричной области ДНК. Они синтезируются химически путем соединения нуклеотидов вместе. Нужно избирательно блокировать и повторно блокировать реактивные группы на нуклеотиде при добавлении нуклеотида по одному. Основное свойство праймеров состоит в том, что они должны соответствовать последовательностям молекулы-матрицы (должны быть комплементарны цепи матрицы). Однако праймеры не обязательно должны полностью соответствовать цепи матрицы; однако важно, чтобы 3′-конец праймера полностью соответствовал цепи матричной ДНК, чтобы можно было продолжить удлинение. Обычно на 3′-конце используется гуанин или цитозин, а 5′-конец праймера обычно имеет участки в несколько нуклеотидов. Кроме того, оба 3′-конца гибридизированных праймеров должны указывать друг на друга.

Размер грунтовки также очень важен. Короткие праймеры в основном используются для амплификации небольшого простого фрагмента ДНК. С другой стороны, длинный праймер используется для амплификации образца геномной ДНК эукариот. Однако праймер не должен быть слишком длинным (> 30-мерных праймеров) или слишком коротким.